Proteomiks analiz için gereken minimum örnek miktarı nedir?

Bu tamamen örnek tipinize ve cevaplamak istediğiniz soruya göre değişebilir. Bu yüzden analize başlamadan önce bize danışmanız sağlıklı olacaktır. Genel olarak, eğer jelden ban keserek protein tanımlama yapmak istiyorsanız, jel boyamasında gözle rahatlıkla görülebilecek bir bant olmasına dikkat edin.  Eğer kompleks bir örnekten analiz yapılmasını istiyorsanız en az 50-100 µg örnekle başlamayı tavsiye ediyoruz. Genel olarak ne kadar fazla protein ile başlarsanız iyi sonuç alma olasılığınız da artacaktır. Eğer kompleks bir örnek içerisinde görmeyi hedeflediğiniz bir protein, ya da protein grubu varsa, bu proteinlerin anlatım düzeylerinin belirlenebilirlikleri açısından önemli olduğunu ve düşük anlatıma sahip proteinlerin kontaminantlar ya da yüksek anlatıma sahip diğer proteinler tarafından baskılanabileceğini göz önünde bulundurun. Bu durumda çeşitli yöntemlerle örnek zenginleştirilmesi yapılmasını tavsiye edebiliriz.

Örneklerimi hangi solüsyon içerisinde göndermeliyim?

Solüsyon içerisinde enzimatik kesim yapılacaksa örnekleri donmuş pelet halinde ya da 8M üre içerisinde göndermek sağlıklı olacaktır.

Eğer örnekler jele yüklenecekse SDS-örnek solüsyonu içerisinde gönderebilirsiniz.

Kesilmiş jel parçaları eppendorf tüp içerisinde gönderilebilir. Jellerin kurumaması için yeterli miktarda saf su ile ıslatılmaları gerekmektedir.

Eğer boncuğa bağlı enzimatik kesim yapılacaksa örnekler deterjansız yıkama solüsyonunda ya da tercihen 50 mM amonyum bikarbonat içerisinde gönderilebilir. Dondurma-çözme işlemi boncuklara bağlı proteinlerde kayba neden olabildiği için bu örneklerin 4oC ‘de, dondurulmadan gönderilmeleri tavsiye edilmektedir.

Genomu sekanslanmamış canlılardan protein tanımlama yapabilir misiniz?

Protein tanımlanması, spektranın bir veri tabanındaki protein sekansları ile eşleştirilmesi ile yapılır. Bu yüzden, prensip olarak, eğer protein veri tabanında yer almıyor ise tanımlanması mümkün değildir. Protein tanımlanması dizi hizalaması (BLAST) temelli bir arama ile yapılmaz. Tek bir amino asit değişimi bile peptidin kütlesini değiştireceği için tanımlanmasını engellemektedir. Bu nedenle homoloji temelli tanımlanma yapılması mümkün değildir. Bu yüzden, tüm genom sekansları protein tanımlanmasında oldukça önemlidir.

Fosforilasyon noktalarını tanımlayabilir misiniz?

Prensip olarak evet, tanımlayabiliriz ancak belirli gereklilikler sağlanırsa. Öncelikle örneklerin fosfataz inhibitörleri kullanılarak hazırlanması ve uzun süre bekletilmemeleri gerekir. Ayrıca özellikle kompleks örneklerle analiz yapılacaksa, fosforile olmayan peptidler, fosforile olanlardan çok daha yüksek oranda bulunduğu için fosfo-peptitlerin maskelenmesine ve tanımlanamamasına neden olur. Bu nedenle bu tarz analizlerden önce mutlaka fosfo-peptit zenginleştirmesi yapılmasını öneriyoruz.

Eğer tek bir proteindeki fosforilasyon noktaları ile ilgileniliyorsa ilgili proteinin örnek içerisinde mümkün olduğunca zenginleştirilmiş olması fosforilasyon noktalarının belirlenebilmesi için önem taşımaktadır.

Diğer translasyon-sonrası modifikasyonları tanımlayabilir misiniz?

Evet, hepsini olmasa da diğer translasyon-sonrası modifikasyonları da tanımlayabiliyoruz. Ancak bize hangi modifikasyonlarla ilgilendiğinizi önceden belirtmeniz gerekmektedir. Asetilasyon, metilasyon gibi bazı modifikasyon daha stabil oldukları için fosforilasyondan daha kolay bir şekilde tanımlanabilmektedir. Ancak özellikle hidrofobik olan (yağ asidi modifikasyonları gibi) bazı modifikasyonların kimyasal özellikleri, standart proteomiks analizlerle tanımlanmalarını engellemektedir. Bu nedenle eğer modifikasyon analizi yaptırmayı düşünüyorsanız öncesinde bizimle irtibata geçmenizi tavsiye ediyoruz.

Jel bandımda sadece tek bir protein görmeyi beklerden çok sayıda protein içeren bir sonuç verdiniz. Bu nasıl mümkün olabilir?

Jelden tek bir bant kesmiş olsanız bile bu bantta birbirine yakın moleküler ağırlıkta olan birçok protein yer alması oldukça olasıdır. Kütle spektrometresinin duyarlılığı, boyama metotlarından çok daha yüksek olduğu için, bu metotlarla ayırt edilemeyen proteinlerin tanımlanması şaşırtıcı değildir. Ek olarak,  kontaminant proteinler, ya da daha yüksek moleküler ağırlıklı proteinlerin degredasyon ürünleri de tespit edilen protein sayısının artmasına neden olabilir.

Listemde birçok keratin görüyorum. Bunlar nerden çıktı?

Keratinler kontaminat proteinlerdir ve örnek hazırlanması ya da işlenmesi sırasında örneğinize bulaşmış olabilirler. Keratin kontaminasyonunun engellenmesi için mümkün olduğunca temiz bir ortamda ve temiz malzemelere çalışılması gerekmektedir. Lütfen kontaminasyonu minimize edebilmek için “Bilgilendirme Klavuzunda”(link) ve “Dikkat edilmesi gerekenler” (link) kısmında bulunan önerilerimizi dikkate alın.

Jel bandımdan bir tane bile protein tanımlayamadınız. Nasıl olur?

Bunun birçok nedeni olabilir. En olası nedeni, başlangıç materyalinin yeterli olmaması ve hazırlık aşamaları sırasında örneğin kaybedilmiş olmasıdır. Bir başka nedeni ise Tripsin ile yapılan enzimatik kesimin doğru gerçekleşmemiş olması olabilir. Tripsin’in çalışıp çalışmadığından endişe etmemeniz için her örnek için gerekli kontroller yapılmaktadır. Tripsin kesim noktaları proteinlerin büyük çoğunda yaygın olarak bulunduğu için genelde bir sorun teşkil etmez. Ancak düşük ihtimalle de olsa bazı durumlarda, eğer proteininin çok küçükse ya da fazlasıyla asidik bir proteinse yeterli Tripsin kesim noktasına sahip olmadığı için kesilememiş ve bu yüzden tanımlanamamış olabilir. Bu gibi durumlarda farklı proteazların kullanılması bir çözüm olabilir. Proteinlerin tanımlanamamalarının bir nedeni de veri tabanında yer almamaları olabilir. Son olarak örnek hazırlama sırasında yapmış olabileceğiniz bir hata (jellerin boyanmasını hızlandırmak için mikrodalgada kaynatmak gibi) proteinlerin geri dönülemez şekilde hasar almasına ve tanımlanamamasına yol açmış olabilir. Bu gibi durumları engellemek için lütfen  “Önemli Bilgiler”(link) ve “Dikkat edilmesi gerekenler” (link) kısmında bulunan önerilerimizi dikkate alın.